Comprender la diferencia entre los métodos directos e indirectos para la inmunofluorescencia.
Las técnicas de inmunofluorescencia (IF) o de imágenes de células se basan en el uso de anticuerpos para marcar un antígeno específico con un colorante fluorescente (también llamado fluoróforos o fluorocromos) como isotiocianato de fluoresceína (FITC). Los anticuerpos que se conjugan químicamente a fluoróforos se usan comúnmente en IF.
El fluoróforo permite la visualización de la distribución objetivo en la muestra bajo un microscopio fluorescente (por ejemplo, epifluorescencia y microscopios confocales). Distinguimos entre dos métodos IF dependiendo de si el fluoróforo está conjugado con el anticuerpo primario o secundario:
Direct IF utiliza un único anticuerpo dirigido contra el objetivo de interés. El anticuerpo primario está directamente conjugado con un fluoróforo.
El IF indirecto utiliza dos anticuerpos. El anticuerpo primario no está conjugado y se usa un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo dirigido contra el anticuerpo primario para la detección.
Los métodos directos e indirectos no se limitan a la inmunofluorescencia. También son relevantes para otras técnicas que dependen del uso de anticuerpos conjugados con fluoróforo tales como citometría de flujo, ELISA, Western blot e inmunohistoquímica.
Detección de proteínas de baja abundancia puede ser a veces desafiante incluso con métodos indirectos. Los anticuerpos biotinilados ofrecen una capa extra para aumentar la amplificación de la señal. (ABCAM.)
