Conseguir proteínas de alta purificación es un requerimiento común para los estudios bioquímicos y de estructura. Un objetivo común es el expresar de manera recombinante una versión de afinidad de la proteína de interés. Sin embargo, esto no siempre es una opción viable. En este reporte discutimos un flujo de trabajo para la purificación protéica desarrollado para proteínas no etiquetadas e introducimos un nuevo indicador de método de rendimiento, el cociente de diferencias de pureza (PQD, de sus siglas en inglés Purity Quotient Difference). Mostramos un ejemplo de estudio sobre el proceso de optimización del flujo de trabajo de purificación de la proteína no etiquetada “prancer purple“ para la búsqueda de la resina óptima, el pH y % xx utilizando el sistema de cromatografía de NGC.
Muestras de proteínas de alta purificación son esenciales para la determinación de su estructura y la caracterización bioquímica para la producción de anticuerpos. Un método estándar para su purificación es el uso de etiquetas de afinidad como la hexahistidina (6xhistidina) o la etiqueta glutation-S-transferasa (GST). Estas técnicas de etiquetado incrementan el rendimiento y eficiencia del flujo de trabajo de la purificación proteíca. Estos protocolos son a menudo fácilmente puestos a disposición o suministrados por el fabricante.
El proceso de etiquetado por afinidad no es siempre un proceso viable. Algunas proteínas son inestable o inactivas una vez etiquetadas o requieren modificaciones post-translacionales que no permiten la expresión recombinada. En estos casos, los investigadores prefieren utilizar una proteína de purificación menor, que explorar por opciones de purificación mas exhaustivas, ya que el proceso de optimización de purificación puede ser muy laborioso cuando no hay columnas de resina específicas o condiciones de tampón adecuadas para lograrlo.
Ya sea para la purificación de proteínas etiquetadas o no etiquetadas, un flujo de trabajo de purificación ideal incluye columna, pH y gradiente de tampón de elución (%B) de optimización para cada etapa de ésta (Figura 1). De esta manera damos a conocer que el sistema de cromatografía de presiones media, Bio-Rad NGC, equipada con válvulas de columna intercambiables, bombas de muestra, válvula mezcladora tampón, y el software con función de exploración ChromLabTM, nos permite el automatizar los procesos de optimización de columna, pH y %B. Usando la no etiquetada, proteína cromogénica “prancer purple“, ilustramos como pequeños cambios en la columna química o pH tiene drásticos efectos en la unión proteíca o cambios en la elución de pH tampón o gradiente pudiendo lograr un gran impacto en la pureza de la proteína estudiada.
Nuestros resultados consolidan la importancia de la columna, el pH y tampón de exploración en el desarrollo de flujos de trabajo de purificación y muestran cómo el sistema de cromatografía de Bio-Rad NGC y el software ChromLab facilitan este proceso y hacen posible que todo investigador pueda trabajar con proteínas no etiquetadas de alta pureza.
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